詳細(xì)介紹PCR擴(kuò)增儀工作原理
點(diǎn)擊次數(shù)：3857 更新時(shí)間：2017-09-26
詳細(xì)介紹
PCR擴(kuò)增儀工作原理
PCR擴(kuò)增儀的工作原理：
PCR反應(yīng)一般設(shè)置20~40次循環(huán)，每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應(yīng)。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板。PCR的擴(kuò)增效率很高，如果循環(huán)次數(shù)是30次，那么新生DNA片段理論上達(dá)到230拷貝（約為109個(gè)分子）。PCR反應(yīng)每個(gè)循環(huán)的三個(gè)基本反應(yīng)步驟如下：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA產(chǎn)物解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：溫度升到72℃左右，DNA模板－引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期（Plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板結(jié)合的特異性。PCR儀也叫基因擴(kuò)增儀，它是利用PCR技術(shù)對(duì)特定基因做體外的大量合成，用于以檢測(cè)DNA/RNA為目的的各種基因分析。
PCR擴(kuò)增儀主要作用原理與基本計(jì)量?jī)x器相似，對(duì)計(jì)量要素要求較高，一旦失控，儀器將不能正常工作，所以PCR擴(kuò)增儀也需要定期保養(yǎng)，依賴自然風(fēng)降溫的PCR擴(kuò)增儀尤需注意。
在儀器的維護(hù)保養(yǎng)中需要注意的問(wèn)題：
1）PCR擴(kuò)增儀需要定期檢測(cè)，一般半年至少一次
2）PCR反應(yīng)的要求溫度與實(shí)際分布的反應(yīng)溫度是不一致的，當(dāng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各孔平均溫度差偏離設(shè)置溫度大于1～2℃時(shí)，可以運(yùn)用溫度修正法糾正PCR實(shí)際反應(yīng)溫度差。
3)PCR反應(yīng)過(guò)程的關(guān)鍵是升、降溫過(guò)程的時(shí)間控制，要求越短越好，當(dāng)PCR儀的降溫過(guò)程超過(guò)60s，就應(yīng)該檢查儀器的制冷系統(tǒng)，對(duì)風(fēng)冷制冷的PCR儀要較*地清理反應(yīng)底座的灰塵；對(duì)其他制冷系統(tǒng)應(yīng)檢查相關(guān)的制冷部件。
4)一般情況如能采用溫度修正法糾正儀器的溫度時(shí)，不要輕易打開或調(diào)整儀器的電子控制部件，必要時(shí)要請(qǐng)專業(yè)人員修理或利用儀器電子線路詳細(xì)圖紙進(jìn)行維修。
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